Nie no naprawdę się wysilili w tym Synektik odnośnie porównania technologi RT-qPCR do RT-LAMP ...
Zastanawialiście się kiedyś, dlaczego to właśnie technologia PCR, która została po raz pierwszy opracowana już w 1983 roku, do dnia dzisiejszego jest metodą referencyjną, tak zwanym „złotym standardem” diagnostyki mikro przepływowej, mimo że przecież od tego czasu powstało kilka nowszych technologii?
Otóż ja zadałem sobie kiedyś to pytanie. 😎 Nie powiem, że temat był prosty, ponieważ moja wiedza na ten temat była wówczas … skromna. 😎 Odpowiedź kryje się za dwoma kluczowymi elementami tej dość skomplikowanej układanki.
Element pierwszy – tajemnicza literka „q”Zgodnie z definicją
skrót RT-qPCR oznacza:
Real Time quantitive Polymerase Chain Reaction, co w tłumaczeniu na język polski oznacza:
Ilościowa (q) Łańcuchowa Reakcja Polimerazy (PCR) w czasie rzeczywistym (RT). I o ile nazwa metody PCR jest tylko opisem technologii, skrót RT, jest dość oczywistym składnikiem tej technologii, to kwestia
„quantitve” czyli „metoda ilościowa” niekoniecznie jest już zrozumiała dla większości inwestorów. A to właśnie „metoda ilościowa” w tej technologii jest jednym z najważniejszych powodów, dla których to
metoda PCR jest „złotym standardem” w diagnostyce molekularnej.Konkretnie chodzi o
możliwość oceny podczas
badania próbki materiału genetycznego
ilości obecnego wirusa lub bakterii oraz oceny czy
podawany lek lub stosowana terapia lecznicza jest w ogóle skuteczna i czy w ogóle działa. A jak można to ocenić nie mając informacji ilościowej do porównania o ilości wirusa i bakterii w badanych próbkach przed podaniem leku oraz po jego zastosowaniu?
Otóż nie da się. Aby ocenić czy dany lek lub metoda leczenia działa, należy wykonać test ilościowy, który wykaże ile konkretnie materiału genetycznego wirusa lub bakterii było w danej próbce przed podaniem leku oraz po jego zastosowaniu i czy po zastosowaniu danego leku lub terapii zmniejszyła się ilość wirusa lub bakterii w organizmie, a co za tym idzie czy i jak skuteczny jest dany lek lub terapia lecznicza. 😎
Żadne
testy serologiczne badające przeciwciała w organizmie
nie są w stanie wykazać czy dany lek jest skuteczny, ponieważ przeciwciała nawet po wyleczeniu pacjenta utrzymują się jeszcze przez długi czas w organizmie, co więcej ich ilość może jeszcze w czasie przyrastać.
Żadne
testy antygenowe badające obecność białka wirusa
nie są wstanie wykazać czy ilość wirusa rośnie czy maleje w organizmie.
Żadne
testy izotermalne (np RT-LAMP), których reakcja obserwowana jest organoleptycznie (ale słowo mi się napisało) poprzez ocenę zmętnienia próbki
nie są w stanie precyzyjnie i dokładnie ocenić ilościowej obecności wirusa czy bakterii w danej próbce.
Zdarzyło mi się wprawdzie znaleźć kiedyś opis w tej technologii jako RT-qLAMP, ale producent wyraźnie opisał w ulotce, iż ocena ilościowa następuję poprzez subiektywną ocenę zmętnienia próbki (sic!!!) 😎 A jak się pewnie domyślacie taka ocena jest niewiele warta w świecie badawczo – naukowym ...
Możliwość oceny ilościowej dają jednak testy PCR ... oczywiście tylko te działające w pełnej technologii RT-qPCR 😎
Drugim elementem bardzo istotnym tej układanki jest „walidacja”.Nie wiem, czy wiecie, ale
test testowi nie jest równy. Oferowane na rynku testy diagnostyczne na wirusy czy bakterie mają dwa rodzaje statusu:
„zwalidowany” oraz „niezwalidowany”. I różnica miedzy tymi dwoma typami testów jest zasadnicza.
Testy „niezwalidowane” nie mają potwierdzonej skuteczności działania w badaniach klinicznych, a jedynie posiadają skuteczność deklarowaną przez producenta (sic !!!). Krótko mówiąc producent taki deklaruje, że jego test jest skuteczny, ale nie podaje żadnego źródła i metody dotyczącej wykonanych prób klinicznych, które by taki test uwiarygodniały. Wtedy taki test posiada opis w ulotce „Reaserch Use Only” co oznacza, uwaga, że test nie może być stosowany do badań laboratoryjnych „in-votro”, a co za tym idzie do ustalania terapii leczniczych dla pacjentów na podstawie tego testu. Taki test jest przeznaczony jedynie do dalszych badań naukowych . Nie miejcie jednak złudzeń, zdarza się, że testy takie trafiają na rynek, szczególnie w sytuacji pandemii . Klasycznym przykładem testów „niezwalidowanych” są testy zakupione przez Ministerstwo Zdrowia w marcu tego roku:
Link:
www.onet.pl/informacje/onetwia...Jak rozpoznać taki test? Otóż w opisie test taki ma wyraźny opis “
Reaserch Use Only”. Przykład takiego opisu znajdziecie na stornie 3 oraz na stronie 17 tej ulotki:
altona-diagnostics.com/files/p...Niestety większość testów na Sars-Cov-2, produkowanych przez większość polskich firm są testami …. „niezwalidowanymi”.
No dobrze czy w takim razie to może testy „zwalidowane” są rozwiązaniem problemu? Odpowiedź na to pytanie brzmi – to zależy … 🙂
Czym są w ogóle testy „zwalidowane”. W testach „zwalidowanych” teoretycznie wykluczono możliwość wystąpienia wyników fałszywie pozytywnych (w przypadku testu na Sars-Cov-2 powinno wykluczyć występowanie innych wirusów – pozostałe koronawirusy, wirusy grypy, adenowirusy, rhinowirusy oraz bakterie typu Mycoplasma lub Chlamydia, ludzki RNA oraz florą fizjologiczną poprzez zastosowanie mechanizmów wykrycia 3 genów specyficznych dla wirusa Sars-Cov-2: N, ORF1ab i/lub RdRP). Ponadto takie testy powinny zostać sprawdzone na dużej próbce losowo rozmieszczonych próbek pacjentów zdrowych i niezakażonych oraz pacjentów zakażonych, którzy zostali wcześniej sprawdzeni przez inny test referencyjny (taki, który funkcjonuje już na rynku i do którego chcemy się porównać). Do tego przy wykonaniu takiego testu w warunkach laboratoryjnych zawsze stosuje się dodatkową trzy stopniową kontrolę laboratoryjną: pozytywną, negatywną i wewnętrzną.
W teorii wszystko pięknie.
A teraz praktyka.Po pierwsze o czym dobrze już wiecie na przykładzie testów na Sars-Cov-2
większość z nich jest testami jedno lub dwugenowymi. Czy takie testy mogą zostać „zwalidowane”? – Mogą, ale wtedy w specyfikacji technicznej takiego testu pojawią się reakcje krzyżowe, które zostały w takim teście wykluczone i powinniśmy odnaleźć tam wiele brakujących elementów. I teraz trochę praktyki. Przykłady dwóch testów uwaga … dwugenowych
Pierwszy test:
medicofarma.pl/coronavirus-tes...(tutaj trzeba pobrać ostatni trzeci plik)
szukamy dwóch elementów:
strona 4 – „
W teście wykrywane są wysoko swoiste fragmenty dwóch genów Sars-Cov-2 ORF1ab oraz gen S”.
Czyli już wiemy, że test jest dwugenowy, ponieważ brakuje w nim trzech sekwencji genetycznych genu swoistego N.
strony nr 11 –
parametry działania testu i tabeli z reakcjami krzyżowymi – Reaktywność krzyżowa „in silico”.
Jest ich całkiem sporo z informacją nie obserwowano reakcji krzyżowych. Test wygląda bardzo dobrze … no ale niestety. Nie jest tak pięknie. Dlaczego?
Ten test nie został w ogóle „zwalidowany”. Czyli producent tylko deklaruje, ale nie zostało to potwierdzone w wynikach badań klinicznych. W związku z tym ten test nie nadaje się do badań laboratoryjnych „in-vitro”, a jedynie do badań naukowych. Powód tej sytuacji jest banalny – gdyby test został „zwalidowany”, to te piękne liczby ze strony 11 dotyczące czułości i swoistości poleciałyby "na łeb na szyję", a tabelka poniżej zrobiła by się prawie pusta … gdyż powstałoby bardzo dużo wykrytych reakcji krzyżowych. No, ale producent przecież tego by nie chciał … bo kto to wtedy kupi?
Drugi test:
www.fda.gov/media/136231/downl...szukamy dwóch elementów:
strona 1: „
For Invitro diagnostic Use” – jest dobrze mamy test „zwalidowany”
strona 2: „
Principles of Procedures” – “
The assay targets regions of the virus nucleocapsid gene (N1 & N3) and is designed for the detection of SARS- CoV-2.”
Ups … mamy test dwugenowy wykrywający dwie sekwencje genetyczne genu swoistego N pierwszą I trzecią, ale brakuje drugiej oraz do dodatkowej kontroli drugiego genu specyficznego ORF1ab lub RdRp … to już wiemy, że będą kłopoty …
strona 14, pozycja 3 „
Cross Reactivity” – tutaj musicie znaleźć drugą stronę nr 14, bo w ulotce producentowi wydrukowały się dwie takie same strony
I co my tutaj mamy. Tabelkę, a w niej reakcje krzyżowe. Na pierwszy rzut oka widać, że reakcji jest mniej niż w teście nr 1. Dlaczego? Ponieważ ten test został „zwalidowany”, a to oznacza, że niestety poprzez walidację okazało się, że zachodzą reakcje krzyżowe z niektórymi wirusami i bakteriami i ten test będzie w ich przypadku pokazywał wyniki fałszywie dodatnie. Co więc zrobić? Usunąć je z listy 🙂 Niestety, ale systemu się nie da do końca oszukać – test dwugenowy musi dać na końcu niską skuteczność ...
No ale można by było pomyśleć – jest nieźle, mimo wszystko sporo reakcji krzyżowych jest wyeliminowanych … niestety nic bardziej mylnego. I tutaj przechodzimy do drugiej części czyli jak prosto zmanipulować wyniki testu robiąc zbyt małą próbkę badawczą.
Strona 16, 9) „
Clinical evaluation” No i co my tu mamy. Na pierwszy rzut oka wszystko wygląda prawidłowo. Próbki zostały zbadane na 60 losowo wybranych próbkach, 30 zakażonych, 30 zdrowych i test w 100% pokrył wyniki :). Wygląda super… otóż nie do końca. Są dwa elementy, które nas wprowadzają w błąd.
Pierwszy to ilość próbek. Jeżeli mamy tylko 60 próbek to znaczy, że mamy zbyt małą ilość wykonanych badań, aby taki test był „zwalidowany” w sposób wiarygodny. Do takiej analizy potrzeba przynajmniej kilkaset próbek, aby wynik był miarodajny. Zresztą zwróćcie uwagę na lipcowe komunikaty SCPFL – zwiększają ilość próbek do kilku tysięcy – właśnie z tego powodu, aby ich test był „zwalidowany” prawidłowo …
Druga kwestia to metoda referencyjna. Dlaczego w teście dwu genowym wyszedł wynik 100% zgodny z testem referencyjnym? Ponieważ zastosowano porównanie do innego testu … dwugenowego. Niestety, jeżeli test byłby „zwlidowany” do testu czterogenowego wyniki spadły by do … ~63%. Co więc mówi nam ta walidacja? Otóż „
porównaliśmy naszą metodę do metody, która ma skuteczność 63% i wyszło nam, że mamy 100% skuteczność do tej metody” Można? 🙂 Można ... 🙂
I to jest niestety najczęściej stosowana manipulacja w walidacji testów nie tylko na Covid-19 … czy trudno ją znaleźć – jak ktoś się dobrze w tym orientuje to nie, ale dla przeciętnego inwestora może to być już „czarna magia” ... 🙂
No dobra, ale to były testy PCR, a co z innymi technologiami? Niestety to samo. Poniżej przykład Genomtec:
genomtec.com/wp-content/upload...I co my tu mamy. To samo. Test dwugenowy badający dwie sekwencje genetyczne genu swoistego N oraz „zwalidowany” system do innego testu dwugenowego, na próbce 67 pacjentów ze skutecznością 100%. Dokładnie ta sama manipulacja co powyżej.
No dobra, ale miało być o testach RT-qPCR i dlaczego to właśnie ta technologia jest „złoty standardem”, a nie tylko o innych technologiach dostępnych na rynku. Ta odpowiedź kryje się za ostatnim elementem „walidacji”, a mianowicie
za trzy stopniową kontrolą laboratoryjną: pozytywną, negatywną oraz wewnętrzną, która to daje możliwości sprawdzenia prawidłowości wyniku (faktycznie poszukiwanego markera genetycznego). W PCR robi się to sondami lub reakcją topnienia (melting), a niestety w innych technologiach taka możliwość nie istnieje. I dotyczy to wszystkich innych technologii dostępnych na rynku. Z tego powodu każda inna technologia niesie dla jej nabywcy ogromne ryzyko i dlatego to te inne technologie nie są wciąż popularna na świecie.
W technologii PCR nie ma tego problemu. Jeżeli ktoś rzeczywiście się zna to wie, że technologia PCR:
-
daje możliwość ilościowej detekcji wirusa lub bakterii w danej próbce (czego nie umożliwiają inne technologie dostępne na rynku), co umożliwia stosowanie skutecznych terapii leczniczych;
-
technologia ta jest wielogenowa (aczkolwiek czas i ilość genów jest do siebie wprost proporcjonalna) co umożliwia tworzenie dobrych testów bez wyników fałszywie ujemnych i fałszywie dodatnich (co nie zmienia faktu, że niektóre firmy i tak to obchodzą);
-
można taki test prawidłowo „zwalidować” na dużej liczbie losowych próbek co daje pewność i wiarygodność takiemu testowi (co niestety często jest manipulowane);
-
umożliwia dokonanie trzy stopniowej kontroli laboratoryjnej w warunkach rzeczywistych: pozytywnej, negatywnej i wewnętrznej (czego nie można wykonać na innych dostępnych technologiach)
I tutaj mamy tak naprawdę
odpowiedź dlaczego to RT-qPCR jest „złotym standardem” w diagnostyce – po pierwsze jako jedyna technologia z dziś dostępnych
umożliwia ilościową detekcję próbki, po drugie
można tę metodę trzy stopniowo kontrolować w warunkach laboratoryjnych, a po trzecie
wszystkie pozostałe elementy diagnostyki są weryfikowalne i sprawdzalne. I dopóki nie powstanie technologia, która również umożliwi detekcję tych wszystkich wskazanych powyżej elementów, dopóty to technologia RT-qPCR będzie „złotym standardem” w diagnostyce molekularnej.
Jeżeli doczytaliście aż do tego momentu, to Was szczerze podziwiam …
ja bym chyba nie dał rady
.